Nach der Zerstörung des Reapers Sovereign im ersten Mass Effect ist der Citadel-Rat der Ansicht, dass die Bedrohung durch die Reaper, die alle 50.000 Jahre das gesamte Leben im bekannten Universum auslöschen, gebannt ist. Obwohl Shepard als Retter der Galaxis gefeiert wird und als Augenzeuge weiß, dass die Reaper nicht so schnell aufgeben werden, schenkt man seinen Aussagen keine Beachtung.

Um die Bedrohung, die offiziell nur von Saren und den Geth ausging, endgültig zu vernichten, wird die „SSV Normandy SR1“ unter Shepards Kommando losgeschickt, um die letzten Nester des Geth-Widerstands aufzuspüren. Bei diesem Einsatz wird das Raumschiff trotz aktiviertem Tarnmodus von einem unbekannten Schiff angegriffen und zerstört. Commander Shepard, der den Großteil seiner Crew zur Flucht in den Rettungskapseln verhelfen kann, wird bei einer Explosion aus der stark beschädigten Normandy geschleudert und stürzt in die Atmosphäre eines naheliegenden Planeten.

Zwei Jahre später erwacht er auf einer medizinischen Station des privat finanzierten Cerberus-Syndikats und erfährt, dass er im Rahmen des „Lazarus-Projekts“ mithilfe von Implantaten wieder zum Leben erweckt wurde. Cerberus und deren Anführer, der Unbekannte, sehen in Shepard und dessen Ruf als Held die einzige Chance, die menschliche Rasse vor den Reapern zu retten. Dazu stellt Cerberus, das der offiziellen Allianz-Regierung Versagen und Untätigkeit vorwirft und deshalb auf eigene Faust handelt, Shepard ein neues Schiff, die „Normandy SR2“, zur Verfügung. Um der Bedrohung durch die Kollektoren, die seit Shepards scheinbarem Tod ganze menschliche Kolonien entführen und allem Anschein nach mit den Reapern zusammenarbeiten, entgegenzutreten, soll Shepard ein neues Team aus den besten Kämpfern des Universums rekrutieren. Während dieser Mission findet Shepard heraus, dass die Kollektoren in Wirklichkeit überlebende Protheaner sind, die von den Reapern gentechnisch verändert und versklavt wurden.

Während sich Shepard auf einer Außenmission befindet, wird die gesamte Crew der Normandy von den Kollektoren entführt. Mit elf Mitstreitern an seiner Seite wagt sich Shepard daraufhin durch das gefürchtete Omega-4-Portal, dessen Ausgang nahe dem Zentrum der Galaxie liegt. Durch die enorme Strahlung in dieser Region und zu ungenaue Portalsprünge wurden bisher alle Schiffe zerstört, die durch das Portal gesprungen waren. Dank verbesserter Schilde und Panzerung sowie Reaper-Technologie gelingt es der Normandy, einen ausreichend genauen Sprung zu vollziehen, den extremen Verhältnissen zu widerstehen und durch das gigantische Trümmerfeld bis zur Kollektorenbasis vorzudringen. Dort gelingt es, das Kollektoren-Schiff, welches die erste Normandy zerstört hatte, zu vernichten. Unter (je nach Spielweise hohen, geringen oder keinen) Verlusten gelingt es, die Crew (oder alternativ einen kleinen Teil davon) zu retten und herauszufinden, wozu so viele Menschen entführt wurden: Nach der Zerstörung der Sovereign benötigen die Reaper einen neuen Vertreter ihrer Art im bekannten Universum und benutzen die Kollektoren, um aus den auf grausame Weise verarbeiteten Menschen einen Mensch-Reaper zu züchten. Dieser kann noch im Embryo-Status zerstört werden. Die Kollektoren-Basis wird entweder gesprengt oder (als abtrünniger Spieler) an Cerberus übergeben. Damit ist die unmittelbare Gefahr gebannt, doch die Reaper sammeln sich in ihrem entfernten Teil des Weltalls bereits zum endgültigen Schlag gegen alles Leben in der Galaxie...